Mở đầu bộ phim Tiếu Ngạo Giang Hồ 3 là sự việc một quan chức của hoàng gia đi kèm với một tàu chiến Bồ Đào Nha đến các vách đá để tìm lại nơi chôn cất của một cao thủ đã tử trận ngày xưa, người đã tự thiến mình để luyện thành Qùy Hoa Bảo Điển và trở thành người co võ công cao nhất trong thiên hạ. 2 phe phái đều có những toan tính riêng của mình trong chuyến đi lần này.

Vị quan chức này phát hiện ra rằng người Bồ Đào Nha thực sự muốn lấy được bí kíp võ công vốn được truyền tai nhau là giúp con người có thể đệ nhất thiên hạ. Tuy nhiên Đông Phương Bất Bại vẫn chưa chết và tìm cách tiêu diệt tất cả những kẻ giả mạo mình hoặc tự lập gia giáo phái giả mạo của mình trước đây, trong khi người Bồ Đào Nha, một lãnh chúa bí ẩn của Nhật Bản và những người khác tìm kiếm Đông Phương Bất Bại.